Noch'ne Frage zu Reflex und Comet Assay (Allgemein)

Alexander Lerchl , Dienstag, 29.03.2011, 15:48 (vor 5009 Tagen) @ Kuddel

Ich versuche mal eine Antwort, so weit ich das aus den Unterlagen beurteilen kann.

Eine einzige E-Zelle mehr oder weniger führt also zu Unterschieden, die größer sind als die Standardabweichungen!

Ich frage mich gerade, wie die Auswertung unter einem Mikroskop praktisch funktioniert:

1.) Es gibt weitaus mehr Zellen, als ausgewertet werden.
Das bedeutet es muß irgendwie eine Auswahl von 500 aud N-tausend erfolgen.

Richtig. Ca. 80,000 Zellen pro Petrischale wurden exponiert / scheinexponiert. Ca. 10,000 - 30,000 Zellen wurden nach der Exposition herauspipettiert und auf einen Objektträger verbracht, mit Agarose vermischt, lysiert und gefärbt. (Nebenbei: die Nachauswertung von Kundi hatte seinerzeit ergeben, dass nur maximal 50 brauchbare Zellen gefunden wurden ...). Die Auswahl der 500 Zellkerne für den Comet-Assay erfolgte willkürlich.

2) Ich vermute mal, die "losen" Zellen sind nicht immer gleichmäßig verteilt
Woher weiß man, wo man mit Zählen anfangen soll und wo man aufhört ?
Zieht man z.B. einen Kreis (Sichtfeld des Mikroskops) und wertet alle Im Kreis liegenden Zellen aus ?

Das ist zwar nicht näher beschrieben (aber vielleicht woanders, das kann ich aber gerade nicht finden), aber normalerweise fährt man den Objekttisch des Mikroskopes mäanderförmig über den Objektträger, um Doppelzählungen zu vermeiden.

Wenn ja,
=> wie kann man bei Beginn Auszählung wissen, daß genau 500 Zellen im Kreis sind ?

Gar nicht, siehe oben.

=> Da es vermutlich unmöglich ist, vor der Zählung einen Kreis oder ein Quadrat um exakt 500 Zellen zu ziehen, wird es relevant werden, in welcher Reihenfolge man mit der Auswertung beginnt.

Ist hier nicht der Fall.

3.) In welcher Reihenfolge werden die Zellen ausgewertet (Kategorie A..F)
=> Fängt man mit den "A-Zellen" an, hat man womöglich die 500 erreicht, bevor die eine "E" Zelle gezählt werden konnte ?
=> Fängt man mit dem Zählen "E"-Zellen an, werden zum schluß dann weniger "A" Zellen ausgewertet, weil die "500" schon erreicht sind ?!?

Jeder Zellkern wurde betrachtet und sofort einer Kategorie (A-E) visuell und manuell zugeordnet.

=> wertet man einfach der Reihenfolge nach zeilenweise von oben nach unten aus , dann stellt sich die Frage:

4.) Nach welchem Kriterium erfolgt die Auswahl der 500 Zellen ?
=> Ich vermute man sucht sich unwillkürlich sich eine besonders "schöne" oder gleichmäßige Stelle auf der Probe, z.B. eine mit einem "E" Kometen in der Mitte.

Nein, siehe oben.

=> Versucht man gar, möglichst viele der seltenen (auffälligen) E-Kometen (=Cluster) in das Sichtfeld zu bringen ?!?

=> Aber besteht dabei nicht die Gefahr, daß man aufgrund dieser subjektiven "Muster" Vorauswahl bereits das Ergebnis beeinflußt (selection bias) ?

Stichwort Entblindung.

Vielleicht war das eine ausgewählte "Cluster" ja einzigartig auf der ganzen Probe von mehreren Tausend Zellen, d.h. die weniger auffälligen Zellen wären stark unterbewertet ?

Alles gut möglich. Aber so wie berichtet wurde, hat die Dame möglicherweise überhaupt nicht ins Mikroskop geschaut, sondern die Daten erfunden:
"Ergebnis: Elisabeth K. habe ihre Daten "offenkundig fabriziert", sagt Schütz. "Es ging ihr um die Erzeugung vorgefasster Ergebnisse." Der tatsächliche Verlauf ihres Experiments hingegen war der Labortechnikerin ziemlich gleichgültig: "Die hat gar nicht ins Mikroskop geschaut", berichtet der Rektor sichtlich verblüfft. "

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"Ein Esoteriker kann in fünf Minuten mehr Unsinn behaupten, als ein Wissenschaftler in seinem ganzen Leben widerlegen kann." Vince Ebert

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Labortechnikerin